U kiralnom HPLC-u stacionarna faza sadrži jedan enantiomer kiralne komponente. Dva enantiomera istog analita se razlikuju u afinitetu prema stacionarnoj fazi sa jednim enantiomerom i zbog toga izlaze iz kolone u različitim vremenima.

Kiralna stacionarna faza se priprema dodavanjem odgovarajućeg kiralnog spoja na akiralni silika gel. Uobičajene kiralne stacionarne faze se baziraju na oligosaharidima kao što su celuloza ili ciklodekstrin.

Kao i kod ostalih kromatografskih metoda, razne kiralne stacionarne faze su pogodne za razdvajanje različitih komponenti.